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Science:重磅!发现迄今为止最小的功能性CRISPR系统—CRISPR-Cas14

一群古老的包含地球上一些最小生命形式的微生物也拥有迄今为止发现的最小的CRISPR基因编辑系统。在这种基因编辑系统中,一种称为Cas14的蛋白与Cas9存在着亲缘关系,但在大小上仅为后者的三分之一。Cas9是革命性基因编辑工具CRISPR-Cas9中的一个发挥作用的蛋白组分。

选自:生物谷
虽然Cas9是从细菌中分离出来的,但是Cas14是在一群古细菌—细菌的原始亲属—的基因组中发现的。Cas9和其他的Cas蛋白是细菌进化出来的保护自己免受病毒入侵的防御系统的一部分。作为靶向酶,它们非常有选择性地寻找和结合细菌中的特定DNA或RNA序列,即那些与CRISPR记忆库中储存的序列相匹配的DNA或RNA序列,随后切割这种DNA或RNA序列,从而阻止新的病毒入侵者。与Cas9一样,Cas14具有作为生物技术工具的潜力。由于具有较小的体积,Cas14可能用于编辑小细胞或某些病毒中的基因。不过鉴于它的单链DNA切割活性,它更有可能改善目前正在开发的用于快速诊断传染病、基因突变和癌症的CRISPR诊断系统。

美国加州大学伯克利分校研究生Lucas Harrington说,“对分子诊断学而言,你希望能够靶向双链DNA、单链DNA和RNA。Cas12非常擅长识别双链DNA,Cas13非常擅长识别单链RNA,如今Cas14凑成全套了:它非常擅长识别单链DNA。”

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Cas14与Cas12和Cas13相类似,这是因为在结合到它的靶DNA序列上后,它开始不加选择地切割细胞内的所有单链DNA。相反,Cas9仅结合并切割靶双链DNA。不加选择地切割单链DNA可能是治疗中的一种缺点,但在诊断方面具有很大的优势。Cas14蛋白可与附着在单链DNA片段上的荧光标记物组合使用。当Cas14与它的靶DNA序列(一种癌基因或传染性细菌中的一种基因)结合并开始切割DNA时,它也会切割与这种荧光标记物连接在一起的单链DNA片段,从而产生荧光信号。

作为Harrington的一名同事,Janice Chen补充道,“Cas14以比Cas12更特异性的方式靶向单链DNA。这真地是一个非常意外的发现。这是因为它太小了,我们几乎认为它无法发挥作用,但是实际上,它是超级特异性的,这使得它成为诊断工具箱的一个非常强大的补充。”

Harrington、Chen及其同事们(包括CRISPR-Cas9发明人、加州大学伯克利分校分子与细胞生物学教授Jennifer Doudna),已对Cas14进行改进,使得它能够用于当前使用Cas12和Cas13快速检测传染性生物和基因突变存在的诊断系统(称为DETECTR)之中(Science, Published Online: 15 Feb 2018, doi:10.1126/science.aar6245)。Harrington、Doudna和Chen是一家名为Mammoth Biosciences的公司的联合创始人,该公司正在将DETECTR商业化。

相关研究结果于2018年10月18日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes”。Doudna是这篇论文的通信作者。

分析宏基因组(metagenome)

Cas14蛋白是由论文共同第一作者Harrington和现任以色列特拉维夫大学教授David Burstein发现的,这是因为他们在过去15年在由他们的加州大学伯克利分校同事们创建的一种微生物基因组数据库中寻找Cas蛋白变体。通过对来自各种外来环境的样品中的所有DNA进行宏基因组测序,他们获得了成千上万种基因组。在从科罗拉多州来复镇(Rifle)的一个有毒的净化场所获得的地下水样品中经过测序的古细菌基因组中发现了Cas14。

两年前,Harrington和Burstein在分析宏基因组学数据库时发现了其他的小Cas蛋白:CasX和CasY(Nature, Published online: 22 December 2016, doi:10.1038/nature21059)。Cas14的长度为400至700个氨基酸,为CasX的一半,而且小于所有其他的长度在950~1400个氨基酸的Cas蛋白。

Harrington 说,“我们偶然发现了这些非常小的蛋白质,但是其他人因它们看起来不像之前已知的CRISPR系统,将它们扔掉了。它们太小了。管它的,我们决定让我们试一试。我们进行了测试,我们非常吃惊地发现这些都是真正的功能性系统。”

在这个数据库中找到编码Cas14的基因只是一个开始。迄今为止,大多数Cas蛋白都是在细菌中发现的,这是因为它们在标准的实验室细菌—大肠杆菌—中很好地发挥作用。但是Cas14来自古细菌,而且是来自一群最小的称为DPANN的古细菌。所有已知的Cas蛋白都会整合一些RNA用于靶向识别和结合,但是Cas14不能与CRISPR-Cas9 RNA一起使用,因此这些研究人员还必须从这个数据库中找到让Cas14发挥功能而必须存在的两种RNA。

此外,DPANN古细菌不能在实验室中培养—它们似乎是寄生性的或者说在某种程度上依赖于其他较大的古细菌,因此这些研究人员必须在试管中创造合适的培养环境。

Harrington说,与Cas14在更原始的细菌中的起源相一致的是,它似乎是更大和更复杂的Cas9和Cas12蛋白的一种更原始的版本,这提示着这些分子已经过更长时间的进化而更具特异性。这些研究人员希望了解这些原始的Cas蛋白,这样他们就能够设计出最紧凑的最时尚的基因切割器。

Harrington指出,这种宏基因组分析发现了Cas14的多种版本,这些版本可能经证实是有用的生物技术工具。他说,“一个令人惊奇的事情……就是这些系统的多样性。我们已描述了40多种新的CRISPR-Cas14系统和8种不同的亚型。这就为研究这些新的CRISPR系统打开了大门。”

(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

Lucas B. Harrington1,*,†, David Burstein2,*,‡, Janice S. Chen et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science, Published Online: 18 October 2018, doi:10.1126/science.aav4294.

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