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单细胞测序困难重重——细胞消化悬浮方案

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随着高通量测序技术(NGS,Next Generation Sequencing)的迅猛发展和普及,走在生命科学前沿的研究者们几乎都在谈论Single-Cell Sequencing对于整个生命科学研究的意义以及价值。无论是肿瘤、发育、神经科学,还是血液免疫或者其他领域,生物学研究似乎进入了一个新的时代——单细胞时代(Single Cell Era),我们的视野越来越精准,从一块组织转为一块组织中的每一个细胞。

   Single Cell Sequencing技术,即利用优化后的高通量测序技术分析每一个单个细胞的序列信息,从而更高分辨率地揭示细胞间的细胞差异以及其在微环境中的功能情况。

走在生命科学研究前沿的急先锋们,已经了解了单细胞测序在各自研究方向上的应用与价值,正摩拳擦掌准备大干一番,却遇到了重重障碍。今天,我们就来聊一聊单细胞测序第一个“拦路虎”—-单细胞消化与悬液制备,以及实验过程中潜在的那些“坑”。

目前,单细胞测序的主要应用领域为人类医学、神经生物学、遗传生殖、干细胞等研究领域,涉及到的主要样品类型十分广泛,但根据其来源,可分为如下几个大类:1)肿瘤组织,如肝癌、胃癌、乳腺癌等;2)实体组织来源的原代分离细胞,如脑神经元、肠道组织来源的上皮及干性细胞等;3)血液来源的某些细胞亚群(一般可以通过不同biomarker进行FACS分选),如通过5色标记的造血干细胞群体;4)干细胞诱导分化/重编程相关的细胞样品。

如何根据自己课题的方案设计及样品类型,选择合适的单细胞制备方法,是事关成败的第一要素!由于CNS文章里的方法学写的都比较笼统,烈冰的实验团队决定自己动手做一批动物实验,摸索并优化出一套更适用的单细胞悬液制备方案。

l 实验目的:比较不同类型胶原酶消化针对不同类型组织的消化效果,摸索出适用于小鼠不同组织器官(如心、肝、脾、肺、肾和脑)的消化条件。

l 实验材料:剪刀、镊子等器械需提前灭菌处理,RPMI-1640,FBS,D-Hanks`缓冲液(也可以换成含有Ca2+的HBBS)。胶原酶I/II/IV/V(具体类型及对应货号如下图)。

l 实验方法:以肝脏、心脏为例,进行演示,详细流程及注释事项如下图所示。

注意事项:

① 解剖小鼠,取其具体靶器官时,一般采取断颈的方式,优势是处理快速、方法通用,但会引起体内局部(尤其是胸腔)内凝血,对心脏、主动脉和肺等组织有一定影响;解剖过程,务必快速准确,尽量减少细胞活性的损失。

② 冲洗过程,一般采用预冷的生理盐水/PBS/D-Hanks`液/RPMI-1640等液体。此步骤注意两点:预冷+维持细胞活性的“液体”。一般情况下,建议RPMI-1640添加FBS至10%终体积(其实就是完全培养液)。也有老师用终浓度1-5%的BSA,其实作用都是为了提高细胞悬液制备过程中的细胞活性。

③ 剪碎过程,注意两点:快速+越小越碎越好。可以准备一次性的平皿,提前注入5-10 ml预冷的完全培养液,在预冷环境中剪碎组织。

④ 胶原酶消化,这一步注意事项较多。首先,明确适用于该组织的胶原酶,详细情况见上面表格;一般情况下,IV型最通用,但特殊类型的组织用单一类型的酶效果更好;另外,根据研究目的,如果样品所处微环境组织类型复杂,可以配成混合型的胶原酶,如II+IV型;第二,使用终浓度,我们整理了20+的CNS文章,发现有作者用质量浓度mg/ml,也有的用活性单位浓度UI/ml,考虑到各公司货品单位质量对应的活性不同,建议以活性单位浓度UI/ml为基准。大多数的II或IV型胶原酶的使用浓度为100-200 UI/ml。最后,注意消化时间。一般情况下,胶原酶在37℃条件下活性最强,消化时间为20-30 min;也有文章在处理肿瘤组织时,消化4 h甚至过夜。不敢多想,深表怀疑。另外,也有老师喜欢用4℃消化过夜的方式,细胞数量和活性也都还不错,可以尝试,但可能不会通用于所有类型的组织。

⑤ 终止酶的消化,一般来说都是加入血清的。但是,由于胶原酶本身不受血清影响,因此,只能采用离心—弃上清—加培养液重悬的“素质三连”来洗去残留的胶原酶。至于细胞碎片,这一步基本上都是通过低转速短时间离心的方式进行的,基本上300 g,5 min即可。既保证活细胞离心收集,又保证细胞碎片悬浮在上清中被弃掉。如果,老式离心机只能调节转速(rpm),没有g这一选项的话,一般情况下是1000-1500 rpm。

⑥ 红细胞裂解,这一步其实很纠结。先说结论,该裂还是要裂的,不过尽量在初步分离细胞的时候把红细胞去除干净。不过,像心脏和肝脏这样的组织,本身红细胞含量就超级高,裂红在所难免。至于为什么纠结,因为有些细胞类型被裂红试剂处理后,会发生聚集并收缩在一团,用移液器轻微的吹打不容易将其分开,会影响后续实验的单细胞得率。

⑦ 最终,在检测细胞活性/数量的时候,要么走经典路线,光学显微镜+细胞计数板+台盼蓝;要么走高科技路线,活/死细胞荧光染料染色后全自动计数仪操作。这里不建议用台盼蓝染色,再全自动计数的仪器,贵不贵不是最重要的,关键是不准确,且批次间可重复性太低,低到你崩溃。明明镜下观察活性相当客观,为何全自动说细胞都挂了呢,不思其解。问了周围的小伙伴,以及销售器材的一些朋友,确实也有不少人碰到过这一情况。

最后,给大家提一些单细胞悬液制备的注意事项:

1) 针对具体组织类型选对酶,以及使用浓度;多种类型组织共存,可配置混合型酶反应液;提前摸索活性浓度;

2) 酶干粉配置母液时要含有Ca2+离子才能激活活性;

3) 需要预冷的,需要室温的,或者需要37℃的,都提前准备好。一般情况下,酶消化用37℃,其他分离过程用4℃减少活性损失(包括离心);

4) 组织剪的越小,分离效果越好;

5) 离心机最好是带g的,300 g+5 min通用全程;不带g的话,1000-1500rpm即可,转速过高,细胞活性会受影响,碎片也越多。

说了这么多,希望对大家的实验有帮助。如果还有其他实验技术疑问,可以关注我们的微信公众号(烈冰生物),烈冰还会陆续分享更多关于单细胞测序的实验技术和数据分析技巧。

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