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纳米孔测序技术发展简介

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随着对DNA结构和序列的研究,DNA测序技术不断发展,成为生命科学研究的核心领域,对生物、化学、电学、生命科学、医学等领域的技术发展起到巨大的推动作用。利用纳米孔研究出新型的快速、准确、低成本、高精度及高通量的DNA测序技术是后人类基因组计划的热点之一。

纳米孔测序技术发展简介

纳米孔检测技术作为一个新型平台,具有低成本、高通量、非标记等优势,可将基因组测序的成本降低到1000美元以下。一些国内外团队积极参与这项研究,尤其是牛津纳米孔公司的Bayley小组首次研发了商用DNA测序设备。纳米孔检测技术有利于促进生命科学的发展,为个体化医疗带来革命,并将人类疾病临床诊断及治疗带入新的时代。

纳米孔分析技术起源于Coulter计数器的发明以及单通道电流的记录技术。生理与医学诺贝尔奖获得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片钳技术测量膜电势,研究膜蛋白及离子通道,推动了纳米孔测序技术的实际应用进程。1996年,Kasianowicz 等提出了利用α-溶血素对DNA测序的新设想,是生物纳米孔单分子测序的里程碑标志。随后,MspA孔蛋白、噬菌体Phi29连接器等生物纳米孔的研究报道,丰富了纳米孔分析技术的研究。Li等在2001年开启了固态纳米孔研究的新时代。经过十几年的发展,固态纳米孔技术日益发展成熟。

纳米孔的基本工作原理:在充满电解液的腔内,带有纳米级小孔的绝缘防渗膜将腔体分成2个小室,如图1,当电压作用于电解液室,离子或其他小分子物质可穿过小孔,形成稳定的可检测的离子电流。掌握纳米孔的尺寸和表面特性、施加的电压及溶液条件,可检测不同类型的生物分子。

纳米孔测序技术发展简介

由于组成DNA的四种碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的分子结构及体积大小均不同,单链DNA(ssDNA)在核酸外切酶的作用下被迅速逐一切割成脱氧核糖核苷酸分子,当单个碱基在电场驱使下通过纳米级的小孔时,不同碱基的化学性质差异导致穿越纳米孔时引起的电流的变化幅度不同,从而得到所测DNA的序列信息。

目前用于DNA测序的纳米孔有两类:生物纳米孔(由某种蛋白质分子镶崁在磷脂膜上组成)和固态纳米孔(包括各种硅基材料、SiNx、碳纳米管、石墨烯、玻璃纳米管等)。DNA链的直径非常小(双链DNA直径约为2nm,单链DNA直径约为1nm),对所采用的纳米孔的尺寸要求较苛刻。

生物纳米孔

生物纳米孔是天然的生物纳米器件,具有特定的孔径结构、生物活性及能够插入脂双分子层膜的能力,由于可进行灵活的化学或生物修饰而受到科学家的青睐。

α-溶血素(αHL)纳米孔

αHL是目前最广泛使用的生物纳米孔的分析物质,由293个氨基酸多肽构成,可插入到纯净的双分子层脂膜中形成蘑菇状七聚体,组装成跨膜通道。αHL七聚体纳米孔主要由帽型区(Cap,入口cis端直径为2.6nm)、边缘区(Rim,直径为1.4nm)和主干区 (Stem,入口trans端直径为2.2nm)三部分构成。αHL 纳米孔永久开通不关闭,耐强酸和强碱,高温、高电压下较稳定。

1996年,Branton小组第一次演示当电流驱使单链DNA穿过镶嵌在磷脂双分子层上的α-溶血素蛋白时会使电流瞬时下降,证明纳米孔蛋白可以用于DNA的检测。随后Kasianowicz等采用α-溶血素蛋白纳米孔对单链DNA、单链RNA易位行为进行研究,提出利用α-溶血素纳米孔实现快速、廉价的DNA测序的设想,是生物纳米孔单分子检测研究的里程碑标志。

英国牛津大学Bayley教授将α-溶血素与核酸酶结合后,利用氨基化环糊精配体固定,将待测核酸上的碱基按顺序剪切后在电场的作用下有序地通过蛋白质纳米孔,使其可以选择性识别四种碱基。英国牛津纳米孔技术公司 (Oxford Nanopore Technologies)成功将该研究成果用于核酸测序。

近期,Schneider小组结合电压控制技术、phi29 聚合酶和α-溶血素纳米孔建立了一个新的测序平台,利用phi29聚合酶将双链DNA解旋,使其中一条单链穿过镶嵌在磷脂双分子层中的α-溶血素纳米孔,通过电流的变化,获得DNA的序列信息。phi29 聚合酶的解旋速度可相应降低DNA在纳米孔中的迁移速度,有利于捕获更为准确的序列信息。

MspA纳米孔

耻垢分枝杆菌中的孔蛋白(Mycobacterium smegmatis porinA,MspA)是适合研究DNA测序的另一个纳米孔蛋白。呈圆锥状,八聚体孔蛋白,有一个宽约1.2nm,长约0.6nm的短窄的收缩区。与5nm长的α-溶血素蛋白孔相比,更有利于对单碱基的测定。Gundlach教授首次报道将核酸末端连接核酸分子夹,利用MspA纳米孔识别四个单碱基的技术,可减缓DNA的穿越速度,提高DNA单碱基的检测灵敏度。

固态纳米孔

固态纳米孔主要是在氮化硅、二氧化硅和石墨烯等绝缘材料上用离子刻蚀技术、电子刻蚀技术、聚焦电子束(FEB)或离子束(FIB)等制作出的微小孔洞。

目前固态纳米孔的制备,首先用常规微加工技术制作30~500nm厚的悬空薄膜,再用离子束或电子束等在硅或其他材料薄膜表面钻出2~100nm的孔洞。DNA检测中所需的纳米孔直径都是1~2nm,可在前述研究的基础上,进一步采用沉淀物质收缩、离子束辐射、电子束辐射等收缩技术减小纳米孔的尺寸,从而达到更小目标尺寸的纳米孔。

哈佛大学Li等在2001年首次报道了使用离子刻蚀技术在Si3N4薄膜上制作出了直径61nm的孔,同时利用氩离子束辐射使纳米孔收缩到1.8nm。开启了固态纳米孔制备和研究的新时代,使固态纳米孔技术日益成熟,丰富了纳米孔单分子检测技术研究。

近十几年来,由于固态纳米孔具有稳定及耐用等特点,越来越受到科学家的青睐,制作固态纳米孔的技术、设备和材料的不断更新,使其研究有着突飞猛进的发展。

利用纳米孔技术对DNA进行测序,要真正实现商业化应用,还面临着严峻的挑战,需要科学家进一步探索,如提高通道的选择性和灵敏度、控制DNA穿越速度及提高信噪比等。除DNA测序外,纳米孔的无需标记、无需放大的单分子检测技术还可以在RNA检测、蛋白质检测等各种重大疾病的生物标志物检测方面得到应用。相信随着纳米孔技术的深入研究,以及各项科学技术的结合使用,将使其在化学、物理学、生物学、电子学和医药学中的应用更加广泛,对生命奥秘的探索、疾病的治疗,以及整个生命科学的发展起到巨大的推动作用。

 

 

基因测序,走在疾病之前的梦想

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2015年的春夏之交,我得知,一个改变我人生轨迹的小生命悄然出现,心底的喜悦居然让我愣了很久,因为我不知道应该怎样去表达,然后,我记得抱着娃她妈原地转了三圈。

之后的日子,为了确保小生命的健康成长,我带着娃她妈不断地做了很多检查,其中包括一项2015年刚刚开始的检测,名叫无创产前基因测序(NIPT),需要自费2200元,准确率高达99.8%。另一种传统的唐氏筛查则已经免费测试,但漏检率居然高达35%。这种情况下,这个钱,不能省。

看起来高大上的基因测序,到底有什么用呢?真能让人类免除疾病的困扰?

面对生命的密码,我们就如同蹲在井底的青蛙,看见阳光滑过井沿。看见了光明,却还没有真正的解密。然而放眼远眺,也许5~10年之后,我们能看到当初那被埋在井底那颗基因的种子,已长成苍天大树。

【1】

基因测序之用

“下一个能够超越我的世界首富必定出自基因领域”——比尔盖茨

虽然,人类基因密码被逐步被揭开神秘的面纱,但直到现在,基因科学更多的应用仍然只是在实验室内,为大家说熟知的,更多来源于电视剧里的法医鉴定身份、亲自鉴定关系等。

实际情况远远不是这样,现阶段基因测序主要的用途比如:针对白血病患儿骨髓移植的HLA分型、罕见病的检测、宫颈癌的预防、癌症的早期诊断、靶向用药。除了应用在人身上,还可以用于分子育种搞笑地选育好的农作物、动植物品种、用于生态治理等等。

那么基因测序能给人的健康带来什么?

1、基因检测可以了解自身遗传背景,检测身体与疾病相关的易感基因,使人们能预测身体患疾病的风险

2、基因检测避免盲目补充保健品,给身体造成不必要的伤害

3、基因检测可以指导健康的生活方式,改善不良的生活环境和生活习惯

4、基因检测可以做到疾病的早知道、早预防、早治疗,主动把握健康。

而距离我们最近的痛点,只有两个方面:

1、优生优育上的运用,针对新生胎儿的无创产前检测(NIPT);

2、癌症类病变的靶向药辅助治疗与早期诊断。

在现阶段NIPT已经被国人广泛接受的情况下,剩下的只是市场、服务与品牌的争夺;而对于癌症类病痛的基因早期诊断肯能会成为基因测序市场的另一个重要突破口。在此需要科普两个概念:基因疾病与精准医疗。

基因疾病

狐狸叔非学术简单解释,顾名思义,就是是正常基因发生有害的突变而产生的疾病。

正常情况,人类的一生应该遵循基因给予的密码进行生长发育乃至死亡。但,基因类突变来自两种情况:

1、有可能出生时,基因本身就携带着疾病的隐患,比如遗传性的疾病,美国影星安吉丽娜朱莉就是家族遗传病基因携带者,因此提前手术去掉了癌症隐患。

2、有可能由于外部环境等因素的影响,导致基因突变出现的病变,则有可能在突变基因已经产生,而尚未出现明显肿瘤类病变是,及时提前治疗。

癌症,其在现代社会的普遍性如何,大家可以自己问问身边的朋友与家人。通过常规的生理检查性,发现时间通常较晚,漏查与错误率都比较高。而通过基因测序,就有了尽早提前发现的可能。

随着技术的不断发展,现阶段做一个简单的基因测序的费用仅人民币几千元,绝大多数人几年做一次基因检测,是能够承受的。因此基因测序在癌症早诊方面,随着消费升级,与相关知识的普及,会逐步成为人民大众常规体检检查的一个项目。现在某些地区已经有小范围的逐步开展。

? 精准医疗

精准医疗(Precision Medicine)是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。2015年1月20日,美国总统奥巴马在国情咨文中提出“精准医学计划”,希望精准医学可以引领一个医学新时代 。

精准医疗作为下一代诊疗技术,较传统诊疗方法有很大的技术优势。相比传统诊疗手段,精准医疗具有精准性和便捷性,一方面通过基因测序可以找出癌症的突变基因,从而迅速确定对症药物,省去患者尝试各种治疗方法的时间,提升治疗效果;另一方面,基因测序只需要患者的血液甚至唾液,无需传统的病理切片,可以减少诊断过程中对患者身体的损伤。可以预见,精准医疗技术的出现,将显着改善癌症患者的诊疗体验和诊疗效果,发展潜力大。

以上两端描述摘抄自百度百科。更多深入的我就不再细说了,只说两点:1、我国的“十三五”首次把精准医疗列为启动一批新的重大科技项目的重点领域。2、我们前面说的沸沸扬扬的很多抗癌创新药,类似于cat-T等,他们的前置检测技术,就是基因测序。

通过以上两个概念的解释,应该能初步说明基因测序技术现阶段最大的方向就在于NIPT、靶向用药与癌症早诊。在NIPT已经广泛普及的今天,

随着改善型消费的提升,癌症早诊将会是下一个基因测序的巨大市场。这个市场达到千亿级别。——狐狸叔

【2】

基因测序产业链情况

马云预测:下一个世界首富将出现在基因领域

首先说一下基因测序的产业链

资料来源:延展产业研究院整理

1.上游:处于产业链最上游的是基因测序仪、测序试剂耗材制造商。

国外的主要公司是Illumina、Thermo Fisher以及Roche;其中illumina占据60%以上的市场份额,短时间内暂无公司可以超越。

国内多采取与国外公司合作授权的形式,主要公司有华大基因(收购CG)、贝瑞和康(联手illumina)与达安基因(联手生命科学,被Themo Fisher收购)。而通过我国CFDA批准的国产测序仪主要如下:

现阶段的主流测序仪仍然是以illumina为主的测序仪。

从产业链整体上看,产业链上游的基因测序仪及配套试剂是整个产业链壁垒最高的部分,短期国外寡头垄断格局将持续,国外公司进入国内的渠道多为与国内领军者合作。

2.中游:是基因测序服务和生物信息分析机构,现今国内最主要也是最成熟的基因测序服务是无创产前基因测序(NIPT),国内市场主要被华大基因及贝瑞和康垄断。

生物信息分析(数据分析)是基因测序行业一大难点,基因测序是一项需要大数据进行基因测序比对的行业,这也是极具发展前景一块业务,荣之联与华大基因合作多年,积累了一定基因测序数据分析经验,是国内为数不多的能够提供生物数据云计算服务的企业。而贝瑞和康则是与阿里云进行合作。

中游技术壁垒较低,且对资金投入要求较低,是目前基因测序产业链中增速最快的领域。也是造成现阶段各类所谓基因测序公司及项目比比皆是的原因。

3.下游:消费群体包括医院病人、药厂及科研机构等,基因组学是未来最被看好的领域之一,在农业、畜牧业、祖先起源、法医取证、生物能源、药物等领域均有广泛应用。

简单来说,就上游技术实力上,illumina无疑是全球第一,而我国主要集中在中游的服务与应用。下游应用端,也会有较大发展的空间。随着行业与技术的发展,专业性细分公司会更加专业,大平台公司也会把触手伸向各个行业,但行业核心公司会逐步走向寡头局面,这是行业与企业发展的必然规律。

因此,在基因测序的整个行业之中,根据我国目前的实际情况,我们需要把焦点对准:基因测序行业的中游、服务于医院和个人的范围内。

基因测序是一个仍然处在发展初期的行业,绝大部分的应用还留在象牙塔的书架之中。面对那些颠覆医疗行业认知的科学技术,应用之路才刚刚开始,如果把眼光盯在当下成熟的技术与应用之中,比如无创产前检测(NIPT),那么其实并没有太大关注的必要。

一项业务并不能代表整个企业,一个企业也不能代表整个行业和市场,整个A股市场,林林总总涉及基因测序概念相关企业49家,未上市企业更是数不胜数。于是,我将目光转向了企业的人,企业的领导者。对于一项发展中的科学,我们需要的不仅仅是企业家,而是有企业精神的科学家。

井蛙的展望

面对基因检测应用于临床医学,到底能有多大的市场空间,并不好确定,NIPT是百亿级市场,而肿瘤早诊是千亿级市场,整个基因测序市场甚至万亿都有可能。

2003年是苹果股价最低的时候,最低达到12.72美元(不复权),而在2018年5月11日,AAPL(苹果)股价创历史新高190.06美元(前复权),算上分红,15年时间,总共成长234倍。

美国基因测序仪公司illumina,2000年纳斯达克上市(ILMN),2003年股价最低1.71美元(不复权)。而在2018年5月30日,ILMN创出历史新高275.34美元(前复权),15年的股价加上分红,同样成长了234倍。

我不想类比苹果,因为乐视之前类比过,结果令人扣腕。对于基因测序市场的展望,无数的研究报告基于当下市场数据,去揣测今后的市场数据,那些都只是预测而已,实际的轨迹总是出人意料。对于整个基因测序市场,挖得越深,我越是感到自己是一只井底之蛙,妄图通过冰冷的数据,去判断一颗种子发芽成长的轨迹。妄图用几个月的时间去享受今后5年、10年甚至更长时间的红利。

面对生命的密码,我们就如同蹲在井底的青蛙,看见阳光滑过井沿。看见了光明,却还没有真正的解密。然而放眼远眺,也许5~10年之后,我们能看到当初那被埋在井底那颗基因的种子,已长成苍天大树。

时值2018年的六一儿童节,我6月2日凌晨仍然在办公室一缕一缕的揪着我的头发,昨天白天勉强陪她玩了一天,今天凌晨2点,战战兢兢地完成此文,希望将此文先给我的女儿。愿生命的密码在几十年后能被更多的被破解,让他们这一代的孩子能享受更多基因密码带来的幸福。

我为她埋下一颗树种,深深地埋入泥土之中,愿它能长成苍天大树,愿科技能让你的生活更美好。(生物谷Bioon.com)

柳叶刀·血液学:基因组测序降低输血风险 如何做到的?

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《柳叶刀 血液学》近日发布了一条论文消息,哈佛医学院和纽约血液中心的科学家们,成功开发出基于全基因组测序的血型分型全新算法——bloodTyper。对照耗时费力的传统测定方法,例如血清学测定法或单核苷酸多态性(SNP)测定法,bloodTyper血型分型的准确度超过90%,且可供在线使用,这将有利于输血前的血型配型,促进安全输血。

大多数人都很熟悉 ABO血型、或Rh血型分型系统, 目前医生圈和相关媒体科普,都是围绕着这类血型。

然而,实际上除了以上血型抗原,红细胞上已知有300多种抗原、血小板上已知有33种抗原,可介导刺激血型不合相关的机体免疫反应。这些抗原的具体表达状态因人而异。根据FDA报告,每年平均报告多达16例与ABO血型无关的血型不合致死的输血病例。目前, 没有任何方法可以测定所有的血型抗原。

临床上输血是较常用的救治措施。血型不匹配引发的输血并发症,可能危及生命。输血前对受者和供者的血型配型,一直是基于ABO 血型和 Rh血型分型测定,这一原则持续了60多年未变。

但是,随着全基因组测序逐渐成为患者的诊疗常规, 人们开始可以通过在输血前通过全基因测序来寻找珍贵救命血型,或识别出高危受者,进而优化输血治疗。

本次《柳叶刀 血液学》报告的全基因组测序血型分型模型bloodTyper, 建立了血型抗原等位基因数据库,基于全基因组测序和计算机辅助全自动算法,来测定分析红细胞和血小板的抗原分型。bloodTyper血型分型算法,有利于常规完成对所有关键血型抗原的遗传预测, 其准确度类似于传统的耗时费力测定方法。如果得到进一步的研究验证,bloodTyper将可能会改变安全输血的理念和实践。

研究人员表示,目前, 大多数情况下,输血供者和受者的血型配型检测中,只包括ABO 血型和 Rh血型配型,并未覆盖所有已知的300多种红细胞抗原和33种血小板抗原。

而bloodTyper这种基于全基因组测序的血型分型测定方法,创造了一种更经济高效的方法,来最大限度覆盖测定更多主要血型抗原,为许多人更好地完成血型配型。

“在需要长期输血的患者中,输血并发症较常见。但是目前缺乏经济高效的血型测定方法,无法有效覆盖所有血型抗原分型,”本研究的第一作者William Lane博士说:”但是,我们已经成功开发的bloodTyper血型分型算法,可以应用于所有人,测定分析每个人的所有的关键血型抗原,只要具备测序条件即可低成本地完成血型分析。”

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